目的 制造活化型bHLH基因Ngn1在猪眼视网膜色素上皮细胞的过表达模型,并观察该基因能否诱导RPE转分化为神经元细胞。
方法 采用电穿孔的方法将人ngn1基因病毒颗粒(RCAS-ngn1)导入原代培养的猪眼RPE细胞中,实验中分别采取不同的电压、脉冲时间、脉冲次数、脉冲间隔。RCAS-GFP作为实验基因的阴性对照。电穿孔后的RPE细胞进行细胞免疫化学检测,检测病毒颗粒标记P27,视网膜神经细胞蛋白标记Arrestin、Recoverin、Red opsin的表达情况。
结果 对不同电穿孔条件进行比较,当电压设置为50mv,脉冲时间为45ms,脉冲数为4次,脉冲间隔为500ms时,细胞中病毒标记物P27的表达率可达到50%,高于其他设置方法。过表达ngn1的RPE细胞可表达微量的Arrestin和Recoverin,而Red opsin表达为阴性。
结论 电穿孔法可以成功将RCAS-ngn1成功导人RPE细胞中。Ngn1诱导猪眼RPE细胞向着神经元细胞的方向转分化,该细胞可表达感光细胞发育早期细胞标记蛋白,但不能表达发育晚期标记蛋白。本实验尝试将哺乳动物RPE转分化为神经元,为细胞移植法治疗视网膜神经元变性提供实验基础。
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