目的 探讨小鼠胚胎干细胞条件培养基（mouse embryonic stem cell conditioned medium，ESC-CM）是否可以促进体外培养的人角膜内皮细胞的增殖。
方法 原代HCECs的培养采用组织块法，将PKP术后的角膜后弹力层及其上的角膜内皮细胞在显微镜下剥除后，组织块培养。实验组为在人角膜内皮细胞培养液（human corneal endothelium medium ，CEM)中添加含25%小鼠胚胎干细胞条件培养液 (25%ESC-CM)，CEM组为对照组。利用形态学和RT-PCR技术来鉴定HCECs。倒置相差显微镜观察两组细胞爬出时间，细胞形态及大小。RT-PCR、Weston-Blot及免疫组化检测ZO-1及Na⁺-K⁺-ATPase蛋白表达情况，RT-PCR检测与HCECs“泵”功能相关蛋白及相关离子通道mRNA水平的表达：电压依从性离子通道-3VDAC3)，碳酸氢钠共同转运体4（SLC4A4)和氯通道蛋白-3（CLCN3)。为了检测HCECs的增殖能力，我们利用Giemsa染色法检测了克隆形成率(CFE)，并用免疫荧光化学和流式细胞学的方法分别检测了增殖相关标记Ki67阳性细胞数、细胞周期、细胞凋亡情况。并用Western blot和免疫荧光化学的方法检测了细胞周期负性调节蛋白P21蛋白的表达情况。
结果 原代培养时，25%ESC-CM组HCECs第2天细胞爬出，CEM组第3～4天细胞爬出，体积稍大。25%ESC-CM组细胞传至P6时细胞仍可保持典型的多角形，体积无明显增大，而CEM组自P2开始细胞体积变大变长，失去多角形结构，至P6时只有细胞体积的增大，细胞数量不增加，细胞内颗粒增多，细胞溶解。P4时25%ESC-CM 组和CEM组的HCECs均表达泵功能相关蛋白ZO-1和Na⁺-K⁺-ATPase，及离子通道相关蛋白VDAC3，SLC4A4，和CLCN。25%ESC-CM组的Ki67阳性细胞率，细胞克隆形成率，突破G1期进入到S期和G2期的百分比均高于CEM组。25%ESC-CM组细胞凋亡率，p21蛋白表达均低于CEM组。
结论 25%ESC-CM可显著促进体外培养的HCECs增殖。其促进增殖的作用可能是通过促进克隆形成，抑制凋亡和抑制P21的表达而实现的。25%ESC-CM培养系统为HCECs体外大量扩增提供了一种新方法。