目的  评价猪角膜后弹力层（DM）作为构建组织工程角膜内皮细胞（CECs）膜片的载体的可行性。

方法  0.2%EDTA消化猪CECs，去除CECs。大气泡分离法将角膜后弹力层与基质分开，放入-20℃，反复冻融3次，即为处理后猪DM。培养兔CECs，以10⁶cells接种于处理后的猪DM，置于37℃、5%CO₂培养。本实验分为4组：①处理后猪DM+兔CECs；②新鲜的带有内皮细胞的兔DM；③新鲜的无内皮细胞的猪DM；④处理后的猪DM。茜素红染色法对比①、②组细胞的形态。共聚焦显微镜比较①、②组的细胞密度。通过扫描电镜观察①、②组细胞间的连接。HE染色法观察①、③、④组DM的结构。采用免疫组织化学法检测细胞角蛋白CK3、紧密连接蛋白ZO-1、Na⁺-K⁺-ATPase、神经元特异性烯醇化酶NSE、异种移植排斥反应抗原α-gal epitope的表达。Real Time-PCR法检测α-gal epitope、猪内源性逆转录病毒的表达。

结果  茜素红染色显示处理后的猪DM无CECs的残留，接种于其表面的兔CECs紧密排列，类似六边形。共聚焦显微镜显示①组接种的细胞密度可达到②组的细胞密度2800cells/mm²。扫描电镜显示①组形成连续的单层细胞，细胞表面布满微绒毛，可见细胞间的紧密连接，其形态结构与②组类似。HE染色结果表明各组DM结构完整。激光共聚焦显微镜下可见①、②组细胞角蛋白CK3表达阴性，未见上皮细胞污染；紧密连接蛋白ZO-1、Na⁺-K⁺-ATPase及神经元特异性烯醇化酶NSE，内皮细胞组合型鉴定标志表达阳性；未检测到猪DM异种移植排斥反应抗原α-gal epitope的表达。Real Time-PCR法未检测到α-gal epitope、猪内源性逆转录病毒在处理后的猪DM中表达。

结论  猪角膜后弹力层可以作为构建组织工程角膜内皮细胞膜片的异种载体。