Purpose: To assess intravitreal injection dose and safety of recombinant adeno-associated virus (AAV)-mediated gene delivery of human NADH dehydrogenase subunit 4 (ND4) in rabbit eyes. 
Methods: An open reading frame for human ND4 or AAV-green fluorescent protein (GFP) were fused to the mitochondrial targeting sequence and packed into separate AAV capsids. Rabbits of three treatment groups were administered 0.1 mL AAV-ND4, 0.1 mL AAV-GFP, or 0.1 mL vehicle via intravitreal injection, respectively. The safety of recombinant AAV-mediated gene delivery of human ND4 in rabbit eyes was assessed with a slit lamp microscope and direct ophthalmoscope, measurements of intraocular pressure and flash visual evoked potential, and optical coherence tomography (OCT). The mRNA and protein expressions of human ND4 in the retina of rabbits were determined with real-time PCR, immunofluorescence, and Western blot. 
Results: No complications occurred in any of the three treatment groups after the intravitreal injection. At one-month post-injection, no significant

 difference in the mean thickness of retinal nerve fiber layer (RNFL) was found among the three groups. Results of the visual evoked potential test showed that there was no difference in the latency of the visual P100 wave among the three groups.  Real-time PCR, immunofluorescence,

 and Western blot analyses verified the expressions of ND4 and GFP in the RNFL.
Conclusions: Intravitreal injection of AAV-ND4 expression vectors was effectively and safely performed in our study. The data on the dose and method of intravitreal injection from 

our study will provide a valuable reference for clinical intravitreal injection of AAV-ND4 for the treatment of Leber’s hereditary optic 

neuropathy.