目的  研究和评估一种新型的视网膜新生血管性疾病的体外模型。在此模型基础上探讨视网膜微血管内皮细胞增生的自分泌途径以及缺氧环境下血管内皮生长因子家族成员发挥的作用。

方法  原代视网膜微血管内皮细胞取自C57/BL6J小鼠视网膜,第3代细胞用于FITC-CD31鉴定。视网膜微血管内皮细胞的缺氧模型用厌氧袋构建，缺氧时间分别为12、24、48、72小时。缺氧模型通过血气分析评估。设立相应时间点常氧环境下培养的视网膜微血管内皮细胞作为对照组。CCK-8法检测细胞增殖。流式细胞术检测细胞调亡率。各组细胞不同时间点VEGF-A, VEGFR-2, iNOs的RNA及蛋白水平通过实时定量PCR及Western blot检测。

结果  血气分析结果显示细胞在厌氧袋中培养时间超过2h，细胞培养液Po2低于5.6 kPa，Pco₂和pH无明显变化。CCK-8结果显示缺氧组各时间点的视网膜微血管内皮细胞增殖能力高于常氧组(p<0.05)。在缺氧环境下，48h细胞的增殖能力达高峰。流式细胞术结果显示缺氧组各时间点视网膜微血管内皮细胞的调亡率低于常氧组。实时定量RT-PCR结果显示缺氧组的视网膜微血管内皮细胞的VEGF-A, VEGF-R2和iNOs的mRNA水平明显高于常氧组(p<0.01)，缺氧组中VEGF-A, VEGF-R2和iNOs的mRNA水平随时间上升，48h达高峰，随后下降。Western blot结果显示VEGF-A, VEGF-R2和iNOs蛋白水平的变化和mRNA的变化相一致。

结论  厌氧袋是建立视网膜新生血管性疾病体外模型的新型有效方法。在缺氧环境下，视网膜微血管内皮细胞可通过自分泌途径，上调血管内皮生长因子家族成员，完成自身增殖，生成视网膜新生血管。