| 目的 用组织工程方法构建角膜上皮组织，用于角膜缘缺陷修复。方法 新西兰白兔15只，1.5~2kg，雌雄不限。受体眼做成角膜缘缺陷动物模型。实验动物随机分成A、B、C三组，每组5只动物。A组为试验组，取供体眼角膜缘上皮组织约2mm3，组织块接种培养法，接种于24孔培养板内培养。细胞达70%融合生长后传代培养。胎酚兰染色观察细胞存活情况。— 4℃保存人羊膜，复水30分钟，0.25%胰酶~0.02%EDTA消化液，室愠下消化30分钟，使上皮细胞脱落。羊膜上皮面向上平铺于Millipore-CM, 孔径0.4um, 直径30mm（millipore公司）插入式培养皿内待用。传代细胞，消化制成细胞悬液，调细胞密度为4×105/ml，接种在底部铺有羊膜的Millipore-CM插入式培养皿内培养。细胞融合后改用气液界面培养两周。以传统培养方法做对照。每日倒置显微镜观察。标本固定后，分别进行病理切片、HE染色，AE1单克隆抗体免疫组化染色，光镜观察。按常规方法制做透射电镜标本，透射电镜观察。A组受体眼祛除角膜浅层新生血管膜，烧灼血管，行自体组织工程化角膜上皮移植。B、C组为对照组，受体眼分别行羊膜移植和不做任何处理。术后缝合睑裂。于手术后7天、10天、20天、30天，裂隙灯检查受体眼，角膜荧光素染色，眼部照相，并分别处死动物，取手术区域角膜组织做病理学检查。结果 原代培养、传代培养细胞能形成良好的单层。细胞接种在羊膜上，气液界面培养，细胞呈复层生长，细胞和载体之间连接较牢固。病理切片HE.染色显示，构建的角膜上皮具有复层鳞状上皮的结构。AE1单克隆抗体染色阳性。与正常角膜上皮结构相似。透射电镜观察细胞之间有较多的桥粒样连接，细胞和羊膜载体之间有半桥粒样连接。传统方法培养细胞易脱落，不能形成明显复层结构。自体组织工程化角膜上皮移植术后，移植区域角膜表面上皮修复，荧光素染色阴性。供体角膜未见病理性损伤。病理组织切片，A组动物：移植区细胞呈复层排列，基底细胞呈明显柱状，基底膜完整，基质内有炎性细胞浸润。B组动物：移植区域表层有上皮细胞覆盖，层次不规则，排列紊乱，极性消失，角膜基质内有炎性细胞和红细胞浸润。C组动物：手术区域角膜上皮细胞排列紊乱，基底膜不完整，基质内有中性白细胞和红细胞浸润。 结论 角膜缘上皮细胞可以进行体外培养扩增。气液界面培养构建复层角膜上皮组织与正常角膜上皮结构相似。自体组织工程化角膜上皮可用于修复角膜缘缺陷。 |
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