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| 人转化生长因子-β1基因克隆、测序及真核表达载体的构建 |
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作者：崔极哲，… 文章来源：吉林大学第二医院眼科 吉林大学基础医学部免疫教研室 点击数：3416 更新时间：2005/5/14 23:57:38 
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| 摘要 目的：克隆人转化生长因子-β1（TGF-β1）基因编码区cDNA序列，构建并鉴定TGF-β1真核表达载体。方法：设计含有EcoRⅠ和XholⅠ酶切位点的TGF-β1cDNA引物，利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法，以人白细胞mRNA为模版，扩增TGF-β1基因，纯化PCR产物，TA克隆，双酶切与pcDNA3质粒表达载体连接，转化感受态大肠杆菌JM109，酶切鉴定阳性重组子，并进行序列测定。结果：琼脂糖凝胶电泳显示，用双酶切后形成分子量1.2kb的条带，符合物理图谱 ，表明表达载体构建成功，序列测定结果与预测结果完全一致。结论：成功克隆了TGF-β1基因，并成功地构建了真核表达载体pcDNA3- TGF-β1。
人转化生长因子-β1（transforming growth factor beta1,TGF-β1），是一种具有多功能的生长因子。其生物学功能非常复杂，在多种组织细胞的增殖分化、间质形成、组织损伤修复、骨质再生、胚胎发育以及免疫调控中起着重要的作用[1]。目前已经证实TGF-β1是一种强效免疫抑制因子，其功能比环孢菌素Ａ（Cyclosporines,CsA）还要强大约104-106倍[2]。近年来的研究发现TGF-β1不仅能通过下调淋巴细胞和巨噬细胞功能等非特异性免疫抑制作用参与移植免疫，还能抑制树突状细胞（dendrtic cell,DC）表面MHC抗原、协同刺激分子的表达，降低DC的抗原呈递功能，干扰DC分化成熟，诱导供者特异性移植耐受[3]。为此我们考虑能否通过增加局部内源性TGF-β1表达来抑制异体视网膜色素上皮（Retinal pigmet epithelium ,RPE）细胞移植免疫排斥反应，诱导产生移植免疫耐受。为了探讨其临床应用的可能性，实验首先构建TGF-β1真核表达系统，为进一步应用奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料 pGEM-T质粒载体（Promega公司）、pcDNA3质粒载体（Invitrogen公司）、Trizol试剂（Invitrogen公司）、RT-PCR试剂盒（TaKaRa 公司，one step）、LA Taq聚合酶 （Takara公司）、dNTP混合物和T4DNA连接酶（Takara公司）、限制性内切酶BamHI、EcoRⅠ/XhoI（Takara公司）、PCR引物（由Takara公司合成）、PCR仪 （Perkin-Elmer/Cetus公司）、DNA回收试剂盒（Takara公司）、DNA Ligation Solution Ⅰ （Takara公司）、大肠杆菌JM109（吉林大学医学部免疫实验室保存）。
1.2 人TGF-β1 cDNA的扩增
1.2.1人白细胞总RNA提取，采用Trizol试剂从人外周血白细胞提取总RNA，实验操作按试剂说明书操作（Invitrogen）。
1.2.2 PCR引物设计，根据人TGF-β1（hTGF-β1）基因序列，分别设计上游、下游2条引物用于克隆hTGF-β1全编码cDNA，上游引物引入EcoRⅠ酶切位点，5′--cgaattcatgccgccctccgggctgc-- 3′；下游引物引入XholⅠ酶切位点，5′--cctcgaggacctcagctgcacttgcag-- 3′。
1.2.3 RT-PCR反应。采用TaKaRa one step RT-PCR试剂盒，按照说明书操作，循环参数位：48℃、30min，94℃、2min，（94℃、1min，55℃、30sec，72℃、1min30sec）30 cycles,72℃ 10min 。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离、回收。
1.3 TA克隆
DNA回收试剂盒（TaKaRa）回收纯化琼脂糖凝胶中由RT-PCR获得的目的基因片段，PCR产物与pGEM-T质粒通过TA克隆进行连接(Promega)，取连接产物1μl电转化JM109感受态细胞（50μl），在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，通过蓝白筛选挑选重组质粒。
1.4 TA克隆阳性重组子的酶切鉴定
挑选平板上的白色菌落（阳性重组子），在2ml Ampenicillin LB培养基中37℃震荡培养过夜，取1.5ml菌液，采用TaKaRa质粒回收试剂盒提取质粒。用EcoRⅠ、XholⅠ双酶切鉴定提取的质粒，根据酶切基因片段大小确定是否为目的基因插入的重组TA克隆质粒。
取10μl酶切产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，并将含有目的基因片段的阳性重组质粒作进一步的DNA序列测定。
1.5 DNA序列分析
采用Applied Biosystems 100 Model 377型DNA序列自动分析仪进行序列测定，将序列分析结果与Genebank比较，序列分析一致的质粒命名为pGEM-T-hTGF-β1。
1.6 真核表达质粒pcDNA3- hTGF-β的构建及鉴定
用EcoRⅠ、XholⅠ分别对TA克隆重组质粒及真核表达质粒pcDNA3进行双酶切，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，对目的基因片段及酶切后的pcDNA3载体进行回收。目的基因片段与酶切后的pcDNA3载体进行连接。取连接产物1μl，电转化感受态大肠杆菌JM109，Ampenicillin LB平板筛选重组子。挑取Ampenicillin LB平板上的菌落，培养，碱裂解法提取质粒。用EcoRⅠ、XholⅠ进行双酶切鉴定。阳性克隆经DNA自动测序仪进行DNA序列测定。鉴定结果正确的重组表达质粒命名为pcDNA3- hTGF-β1。
2. 结果
2.1 RT-PCR法扩增hTGF-β1 cDNA
提取人白细胞总RNA，经一步法RT-PCR扩增目的基因片段，PCR产物经1.5% 琼脂糖凝胶电泳鉴定显示为一条强的DNA带，大小约为1200bp（图1-1），与理论预期结果相符。
图1-1. PCR扩增产物琼脂糖电泳鉴定
2.2 TA克隆
纯化的PCR产物与pGEM-T质粒在T4 DNA连接酶作用下进行TA克隆连接，连接产物电转化感受态大肠杆菌JM109，经蓝白筛选挑取阳性重组子，进行质粒快速抽提鉴定大小，对于可能含有目的基因插入的重组质粒进行EcoRⅠ和XholⅠ双酶切，酶切产物采用琼脂糖电泳鉴定，结果如图1-2，插入目的基因片段约为1200bp，酶切鉴定结果与预计的含有目的基因插入质粒的结果相吻合。
取插入目的基因片段大小正确的pGEM-T重组质粒进行DNA序列分析。根据pGEM-T质粒酶谱特点，采用通用引物T7、SP6进行正反两个方向的DNA序列自动分析，分析结果显示所克隆的hTGF-β1 cDNA核苷酸顺序与Genbank一致（图1-3，附后）。将正确的TA克隆重组质粒命名为pGEM-T- hTGF-β1。
图1-2. pGEM-T重组质粒的双酶切鉴定
M.分子量标准（DL2000）。P. pGEM-T-hTGF-β1质粒(不同的3个菌落)
2.3 真核表达质粒pcDNA3- hTGF-β1的构建及鉴定
通过EcoRⅠ和XholⅠ双酶切，将pGEM-T-hTGF-β1中目的基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3，构建真核表达质粒pcDNA3-hTGF-β1。重组质粒pcDNA3-hTGF-β1电转化感受态大肠杆菌JM109, 抽提质粒进行EcoRⅠ和XholⅠ双酶切，同样切出一条1200bp片段，酶切鉴定结果与预计一致。取正确亚克隆的重组表达质粒纯化后，采用上游引物进行正向的DNA序列分析，分析结果显示所克隆的pcDNA3-hTGF-β1重组表达质粒的hTGF-β1 cDNA阅读框架正确。该表达质粒用于以后的实验中。
3. 讨论
目的基因在转染的真核细胞内的稳定表达，最关键的因素是真核表达载体的构建及所构建的载体的结构和功能。作为真核表达载体应具备以下条件[4]：⑴表达型载体具有自主复制的信号，并配备有与宿主细胞相适应的启动子、增强子和加尾信号等，个别载体能够整合到宿主细胞基因组中与其一同复制。⑵载体相对分子量要小于3×103~10×103为宜，便于DNA体外操作和转入宿主细胞。⑶有一段对于它们在宿主细胞内繁殖非必须DNA区域，其中含有多功能酶切位点，便于插入外源的DNA。⑷载体上应有筛选标记，如抗药性基因等（LacZ和neo），一是有利于检测是否插入了目的基因，另外一点是有利于检测其是否有效导入到细胞内。
本实验采用的真核表达载体pcDNA3有以下几方面的特点[5.6]：⑴从结构上看，该质粒载体具有很强的复制能力，完全可以满足随宿主细胞增殖分裂时随胞浆遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一；⑵含有高效增强子SV40，它是一类能促进基因转染活性的顺式调控元件，而且在目的基因前（多克隆酶切位点前）装有功能很强大的基因启动结构T7 PCMV，使目的基因的表达得以保证，有可能随宿主细胞分裂，随细胞遗传给子代细胞。可在一定程度上保证目的基因稳定传给新增殖的细胞；⑶有多克隆酶切位点；⑷具有抗药基因neo，故可以应用G418来筛选阳性转染的靶细胞。已有很多的实验证明pcDNA3是一种具有高表达功能的载体[7-9]。
总之，本实验利用RT-PCR法从人白细胞中获得hTGF-β1 cDNA全编码片段1200bp，通过与pGEM-T质粒TA克隆连接，获得正确的TA克隆重组质粒，命名为pGEM-T- hTGF-β1。然后利用EcoRⅠ和XholⅠ双酶切，将pGEM-T-hTGF-β1中目的基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3中，成功构建了真核表达质粒pcDNA3- hTGF-β1。为将hTGF-β1基因转染RPE细胞稳定表达，并进一步将hTGF-β1基因修饰的异体RPE细胞移植到视网膜下腔治疗RPE细胞变性疾病的基因治疗奠定了基础。
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| 会议投稿录入：cuijizhesa 责任编辑：毛进 |
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