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| 野生型与Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒的构建及表达情况的对比研究 |
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作者：王建文 孙… 文章来源：天津医科大学眼科中心 点击数：1526 更新时间：2005/5/29 1:21:27 
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| 目的：克隆人MYOC基因，构建野生型和Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒，并研究两者蛋白表达的差别，以便进一步了解原发性开角型青光眼（primary open angle glaucoma ,POAG）的发病机制。方法：用RT-PCR法，从人眼组织（角膜缘，睫状体）中扩增MYOC基因cDNA，克隆入载体pGEM-T，构建成pGEM-T-MYOC质粒，并以pGEM-T-MYOC质粒中MYOC为模板，用PCR介导的定点突变技术，得到Pro370Leu突变型MYOC基因（mMYOC），然后分别酶切下MYOC和mMYOC基因，分别定向克隆到真核表达质粒pEGFP-N3和pDsRed2-N1中，构建pERFP-N3-MYOC和pDsRed2-N1-m MYOC重组表达质粒，然后用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定，最后用脂质体包埋转染法将两种质粒分别及共同转染Hela细胞，进行荧光显微镜观察和Western Blot分析蛋白表达情况。
结果：经酶切和DNA测序鉴定，证实两种重组质粒构建正确，荧光显微镜观察到MYOC蛋白和mMYOC蛋白均成功表达，都定位在细胞质中，但wMYOC蛋白分布均匀，而mMYOC蛋白呈聚集状态。共表达时，MYOC蛋白也呈聚集状态，且与mMYOC蛋白有共定位倾向。经Western Blot分析,相应的转染细胞可分泌MYOC蛋白，而不能分泌mMYOC蛋白，共转染时，也检测不到MYOC蛋白分泌。
结论：野生型与Pro370Leu突变型MYOC基因都能成功表达，都定位在细胞质，但mMYOC蛋白表现为聚积倾向和分泌障碍，并且影响MYOC蛋白的表达和分泌特性。这种差别可能就是MYOC基因突变所致POAG发病的分子基础，这为进一步研究MYOC基因突变在POAG发病中的作用奠定基础。 |
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| 会议投稿录入：wxcwjwhome 责任编辑：毛进 |
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