| 角膜硷烧伤是严重的致盲性疾病之一。随着角膜移植手术的普及和眼科新药的不断开发及临床应用，使绝大多数患者的视力得以保留，但仍有部分患者视功能的恢复不能令人满意。究其原因，既角膜损伤后角膜上皮细胞的生长受到严重损害所致，因此角膜损伤后上皮组织功能的快速修复，就成为当今眼科领域有待解决的问题关键。
表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）是一种6KD碱基的小分子促生长因子，主要存在于人的脑、肾脏、肾上腺髓质、唾液腺、十二指肠腺、皮肤等组织。目前研究表明，它具有促进内、外胚层组织的分裂和合成代谢，促进创伤和烧伤组织的愈合，增加某些细胞内的离子传递，诱导内源性蛋白质的磷酸化，改变细胞形态和刺激DNA合成等多种功能。就眼科而言，现已证实，EGF对角膜烧伤的修复，对角膜损伤的愈合，对体外培养的角膜细胞的促生长及促分裂等均有明显的效果。由于EGF独特的功能及临床疗效，使眼科临床工作者对其备受关注。
目的：
本研究利用基因重组技术，基因构建了人表皮生长因子（recombinant human epidermal growth factor, rhEGF）全基因序列，并将该序列插入真核细胞高效表达穿梭质粒pcDNA3.1内，用脂质体包裹后制成基因缓释型滴眼液；用该滴眼液对家兔角膜硷烧伤进行了治疗，希望找出一种新的局部治疗方法和基因治疗药物。
方法：
首先从GeneBank获得人表皮生长因子（human epidermal growth factor, hEGF）的全基因序列，利用DNAsis基因分析软件设计合成hEGF的巢式PCR引物，从胎儿腮腺和颌下腺组织中提取总RNA作为模板，经RT-PCR和PCR基因扩增首先得到hEGF的cDNA基因片段，将其插入PGEM克隆载体，基因测序确认hEGF全基因序列无误后，经内切酶切后再将其插入真核细胞高效表达穿梭质粒pcDNA3.1内，完成表达载体的基因构建。将基因构建的人表皮生长因子（recombinant human epidermal growth factor, rhEGF）全基因序列导入大肠杆菌JM109体外培养，经提取纯化后再将rhEGF - pcDNA3.1用脂质体包裹制成基因缓释型滴眼液；用常规方法制成家兔角膜硷烧伤动物模型，用以上滴眼液进行局部滴眼治疗，整个疗程仅需滴眼一次，每次一滴（约含7.5ug rhEGF-pcDNA3.1）。分别在治疗后的第1、3、7、14、21和28天处死家兔，用ELISA、RT-PCR和PCR法分别测定rhEGF在家兔角膜组织中的蛋白质、mRNA和DNA的表达水平。
结果：
在治疗后的第3天从实验组眼角膜组织中分别扩增出rhEGF的mRNA和DNA基因序列，并持续表达28天以上；用ELISA法在第7天检测出rhEGF的蛋白质表达，表达高峰在第7天，表达水平为224.29ng/克角膜湿重，随后逐渐降低，持续表达时间为21天（其中一样本组织在第28天仍为高水平表达）。
结论：
EGF蛋白滴眼液目前已有成品上市，但由于EGF为小分子蛋白，在体内半衰期很短，仅1.5h，因此用EGF蛋白滴眼液局部治疗就很难得到理想的疗效，而EGF基因缓释型滴眼液的治疗原理则不同，该滴眼液一经应用，rhEGF 就会在 pcDNA3.1真核高效表达穿梭质粒的作用下和脂质体的包裹下直接进入受损局部周围组织的细胞核内，随着局部组织细胞的代谢和分化而直接在一定时间内持续分泌产生新鲜的EGF蛋白，直接参与局部损伤组织的修复性治疗。该滴眼液的特点是：1.使用方便，对每位患者的整个治疗过程仅需治疗一次，每次仅需滴一滴；2.一次给药可持续治疗20天左右，随后rhEGF-pcDNA3.1既被局部组织逐渐降解；3.无任何不良反应和痛苦。该滴眼液的研制成功，是传统滴眼液使用方法的一次革命，将具有明显的社会效益和经济效益，应用前景广阔。 |
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