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大鼠BDNF基因克隆和重组逆转录病毒pLXSN-BDNF的构建及包装 |
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作者:邵正波1 … 文章来源:哈尔滨医科大学附属第二医院眼科 150086 点击数: 更新时间:2006-7-4 10:20:52
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目的 克隆大鼠脑源性神经营养因子基因(BDNF)并构建含BDNF基因片段的真核表达载体pLXSN-BDNF,在体外进行包装,以获得稳定的产毒细胞株,对BDNF基因治疗视神经损伤进行了初步探索,为今后研究神经营养因子在视神经保护中的应用奠定基础。方法 提取大鼠海马组织的总RNA,逆转录合成cDNA第一链,以其为模板扩增目的基因BDNF。将目的DNA片段和pMD18-T Simple克隆载体连接,转化至E.coli感受态JM109中,选取阳性菌落提取质粒后测序鉴定。以pMD-BDNF为模板扩增BDNF基因片段,EcoR I和Xho I双酶切BDNF和 pLXSN,再将BDNF基因和pLXSN的酶切产物连接成pLXSN-BDNF。筛选重组子,送测序。转染PA317细胞系,对重组质粒进行包装,用G418进行筛选。通过PCR和RT-PCR的方法分别对产毒细胞株和病毒上清液进行检测。结果 将扩增的BDNF基因片段克隆入pMD18-T Simple载体,获得阳性克隆pMD-BDNF,测序鉴定与已知序列相符。取测序正确后将BDNF基因亚克隆入逆转录载体pLXSN,得到重组质粒pLXSN-BDNF。经过PCR、酶切和测序鉴定,所克隆的BDNF基因序列正确,克隆的BDNF基因已经正确插入到逆转录病毒载体pLXSN中。通过对病毒的包装筛选及PCR和RT-PCR技术鉴定,细胞基因组中已整合入BDNF基因,包装细胞PA317可以分泌重组的逆转录病毒。结论 本实验成功克隆了大鼠的BDNF基因,并构建了重组的真核表达质粒pLXSN-BDNF,通过病毒包装,获得了稳定的产毒细胞株。pLXSN-BDNF病毒的获得为今后感染神经干细胞,探索以神经干细胞作为基因工程细胞,促进神经元再生和修复,对神经损伤性疾病开展基因治疗的可行性研究奠定了实验基础。
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会议投稿录入:aya610 责任编辑:毛进 |
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