人神经营养素-4基因重组腺伴随病毒载体的构建、产生和滴度测定

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人神经营养素-4基因重组腺伴随病毒载体的构建、产生和滴度测定

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人神经营养素-4基因重组腺伴随病毒载体的构建、产生和滴度测定

作者：张华赵家… 文章来源：中国协和医科大学中国医学科学院北京协和医院眼科 100730 点击数：4208 更新时间：2006/7/10 17:08:43

目的为了研究人神经营养素-4（hNT-4）导入青光眼模型的治疗作用，构建并产生重组腺伴随病毒载体。方法将hNT-4目的基因插入载体质粒pSSHGCMV的EcoR I 和 BamH I位点之间，构建重组腺伴随病毒载体质粒。用腺病毒辅助质粒pFG140代替野生型腺病毒，包装质粒pAAV/Ad及已构建重组腺伴随病毒载体质粒，三质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的143细胞系，包装rAAV。经蔗糖梯度离心法纯化、斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果成功构建了重组病毒质粒pSSHGCMV/ hNT-4。用腺病毒质粒代替野生型腺病毒不影响重组病毒的产生和滴度，而且可以减少野生型腺病毒的污染。用蔗糖梯度离心法离心获得rAAV，使用斑点杂交方法测定重组病毒滴度，杂交结果与已知浓度重组质粒杂交结果比较，获得了较高滴度的重组病毒结论成功制备了人神经营养素-4基因重组腺伴随病毒rAAV/ hNT-4，为青光眼基因治疗实验奠定了基础。

会议投稿录入：aya610 责任编辑：毛进

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