目的 建立基于Smad3的抗滤过道瘢痕化药物高通量筛选体系，为青光眼滤过道瘢痕化防治药物的研究提供一个理想的技术平台。
方法 首先采用PCR方法从质粒pGL2-control中扩增获得SV40弱启动子，并以其替换质粒pEGFP-N1中的强启动子CMVIE，获得pSV40-EGFP质粒。提取两份pSV40-EGFP质粒，其中一份以XhoⅠ、HindⅢ双酶切获得含有EGFP的质粒骨架，另一份用BglⅡ、HindⅢ双酶切获得含SV40启动子的质粒片段。用T4-DNA连接酶连接含有EGFP的质粒骨架、含SV40启动子的质粒片段及人工合成的4×COL1A2基序(具有XhoⅠ、BglⅡ粘端)，获得p4COL1A2-EGFP质粒，并以pZsGreen1-DR质粒中ZsGreen1-DR片段替换p4COL1A2-EGFP质粒中的EGFP片段，最终获取报告质粒p4COL1A2-ZsGreen1DR。将p4COL1A2-ZsGreen1DR报告质粒转染兔Tenon`s囊成纤维细胞（TCFS），G418筛选后获得Smad3反应性报告细胞株TCFS-ZsGreen1DR。培养后加入TGF-β1(12.5 ng/ml)，通过荧光显微镜观察及流式细胞仪检测不同时相点TCFS-ZsGreen1DR细胞ZsGreen1DR的表达。将TCFS-ZsGreen1DR细胞株冻存1个月后，复苏并传代培养1个月，加入TGF-β1，观察不同时相点ZsGreen1DR的表达情况，据此评价Smad3反应性报告细胞株TCFS-ZsGreen1DR的稳定性。
结果 （1）质粒酶切、PCR以及测序鉴定结果表明，Smad3反应性报告基因载体p4COL1A2-ZsGreen1DR序列符合预期设想，报告质粒构建成功。（2）将报告质粒p4COL1A2-ZsGreen1DR转染TCFS细胞，经G418筛选后，获得Smad3反应性报告细胞株TCFS-ZsGreen1DR，提取TCFS-ZsGreen1DR细胞基因组DNA进行PCR鉴定，结果表明：细胞株TCFS-ZsGreen1DR中含有p4COL1A2-ZsGreen1DR质粒。基于Smad3反应性报告细胞株构建成功。（3）TGF-β1诱导表达实验结果表明，1号体系加入TGF-β1前及加入TGF-β1在0 h时，TCFS-ZsGreen1DR表达荧光的平均光密度为0.006±0.001；在4 h时TCFS-ZsGreen1DR荧光的平均光密度为0.234±0.065；在12 h达到高峰，平均光密度为0.615±0.024；在24h时细胞平均光密度明显下降，平均光密度为0.221±0.023。（4）将TCFS-ZsGreen1DR细胞株冻存30天，复苏并传代培养1个月，加入TGF-β10 h时，TCFS-ZsGreen1DR表达荧光的平均光密度为0.005±0.002；4h后TCFS-ZsGreen1DR的平均光密度为0.214±0.032；12 h时的平均光密度为0.587±0.133；24h时的平均光密度为0.208±0.074；说明TCFS-ZsGreen1DR细胞株经冻存、复苏、传代后仍能有效反映TGF-β1对Smad3的诱导激活作用。
结论 （1）成功构建了以Smad3顺式作用元件4×COL1A2基序为增强子、以SV40为启动子，以ZsGreen1-DR为报告基因的真核表达载体p4COL1A2-ZsGreen1DR。（2）将真核表达载体p4COL1A2-ZsGreen1DR转染TCFS细胞，经G418筛选后，获得了Smad3反应性报告细胞株TCFS-ZsGreen1DR，即基于Smad3的抗滤过道瘢痕化药物高通量筛选体系。（3）经TGF-β1诱导表达实验及Smad3 TFD抑制ZsGreen1DR表达实验证实，TCFS-ZsGreen1DR报告细胞株可通过荧光强弱变化敏感地监测Smad3的活性改变，从而反映外源性物质对TGF-β作用的阻断效果，据此可进行抗滤过道瘢痕化药物的筛选。（4）TCFS-ZsGreen1DR细胞株(基于Smad3的抗滤过道瘢痕化药物高通量筛选体系)具有可靠的稳定性。 | 
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