目的 TGF-b(Transforming Growth Factor b)介导Tenon囊成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,是纤维化过程重要的调控因子。本研究通过筛选靶向TGF- bⅡ型受体胞外段(rhTGF-b sRⅡ)的核酸适配子,并在体外实验探讨其阻抑TGF-b介导的成纤维细胞转分化过程。
方法 体外设计、合成长度为108nt、包含60个随机核苷酸序列的ssDNA随机库,与靶蛋白rhTGF-b sRⅡ行SELEX筛选,将筛选得到的ssDNA克隆、测序,利用膜结合实验检测核酸适配子与靶蛋白的亲合力。原代培养人Tenon囊成纤维细胞,分组处理细胞:正常对照组,TGF-b2(2ng/ml)刺激组,TGF-b2(2ng/ml)与核酸适配子S58/68共同作用组,核酸适配子S58/68作用组,采用Western blot检测平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin, a-SMA)、pSmad2蛋白表达变化,应用共聚焦免疫荧光显微镜观察细胞a-SMA定位表达以及细胞骨架蛋白(F-actin)分布情况。细胞凝胶收缩实验检测细胞收缩力的变化。
结果 经过8轮筛选后,富集库对rhTGF-b sRⅡ的亲和力较初始库明显升高,从0.76%上升到22%。Western blot结果显示TGF-b2作用24h后细胞a-SMA表达明显高于对照组,而与核酸适配子S58共同作用24h后细胞a-SMA表达较TGF-b2作用组显著降低。作用不同时间点(10min,30min,1h,2h)显示S58均能减少TGF-b2介导的pSmad2蛋白表达。细胞凝胶收缩后面积占初始面积的百分比:正常对照组为38%;TGF-b2(2ng/ml)组为22%;S58(20nM)干扰组为41%。
结论 成功建立了SELEX技术筛选rhTGF-b sRⅡ亲和核酸的方法,核酸适配子S58能有效地阻抑TGF-b2介导Tenon成纤维细胞a-SMA蛋白的表达以及细胞收缩,且可能与Smad信号转导途径相关。
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