以羊膜为载体的人角膜缘干细胞体外扩增培养研究

目的观察在完整羊膜与去上皮羊膜两种不同载体上所培养角膜缘干细胞的生长特点及P63表达情况。
方法采用体外扩增培养人角膜缘干细胞，角膜缘组织来源于2010年9月—2011年2月在我院眼科行手术治疗的病人志愿者健康角膜缘组织(共10例)，取角膜缘12点位置vogt栅栏区内约3×2× 1mm角膜缘组织，不含结膜组织。将所取新鲜角膜缘组织剪成1.5mm左右的小块，每块随机种植于完整上皮羊膜（A组）、去上皮羊膜（B组），每组10孔。完整羊膜为无菌获取并冻存，使用前复苏解冻并水化，去上皮羊膜为完整羊膜在胰酶及EDTA中消化后刮除上皮细胞。角膜缘干细胞采用组织块培养法，DMEM+HamsF12(1:1)培养液，并添加了相同的营养因子（10ng/mlrhEGF、20%FBS）。倒置显微镜下观察培养细胞体外生长的形态。细胞培养14天时，选用 p63 抗体运用免疫细胞化学方法鉴定培养细胞中是否含有具有增殖潜力的角膜缘干细胞。
结果角膜缘组织块在两种载体上均能成功的体外培养扩增，以细胞能向外扩增、细胞形态及贴壁好、细胞间排列紧密为培养成功的标准，A、B两组细胞（每组10例）分别培养成功9例。两组中分别来自同一组织的2例，生长3天后见细胞漂浮起、停止生长死亡。两组细胞生长1～3 天从组织块周边爬出形成“沙滩样”移行带，刚刚移行出的细胞多为圆形、透明、细胞体积小、核质比大，两组细胞培养至第14天时呈现类圆形和多边形，部分细胞体积变大、核质比缩小，细胞间排列紧密、贴壁良好，并且可见部分长梭型成纤维细胞生长。 B组细胞生长平均7.6±0.73天可见连接成片（共9例），A组细胞生长平均13.2±0.97天可见连接成片（共9例），B组细胞13天左右向外生长速度变缓慢。两组细胞生长14天时做免疫细胞化学染色，共18孔细胞中均可见P63阳性细胞，其中A组细胞P63阳性率高于B组细胞（P＜0.05）。
结论 1.角膜缘干细胞在完整羊膜和去上皮羊膜上均能体外扩增，组织块培养法成功率较高。 2.以去上皮羊膜为载体的角膜缘干细胞增殖分化快，体外扩增14天后原始细胞数量较少；以完整羊膜为载体的角膜缘干细胞生长周期长、体外扩增14天后原始细胞数量较多。两组细胞生长14天时，A组细胞P63阳性率高于B组细胞（P＜0.05）。