GRP78在原发性开角型青光眼病人小梁细胞表达下调的研究

目的本研究通过体外培养人眼小梁细胞，将衣霉素（Tunicamycin）、十字孢碱(Staurosporine)分别作为内质网应激及凋亡处理因素，分子生物学方法检测内质网应激反应伴侣蛋白GRP78在体外培养的正常人及原发性开角型青光眼（POAG）病人眼小梁细胞内蛋白及mRNA表达水平的变化。旨在从新的角度解释GRP78在细胞凋亡中可能发挥的作用，细胞凋亡数目的增多进而影响房水流出阻力的调节机制，为POAG的发病机理的研究提供新的思路，为探讨其治疗措施提供新的方向。
方法 1.人眼小梁细胞的体外培养和鉴定：用组织块培养法培养正常人小梁细胞(NTM)及POAG患者小梁细胞(GTM)，显微镜观察、免疫细胞化学等方法鉴定小梁细胞；2. 药物处理小梁细胞：将细胞分为空白组、对照组和处理组，处理组细胞培养液分别添加Tunicamycin（Tm）、Staurosporine（STS）、对照组添加dimethylsulfoxide (DMSO)进行细胞培养观察内质网伴侣蛋白GRP78表达的改变；3.应用MTS法检测Tm、STS对人眼小梁细胞的毒性；4.应用Real-time PCR检测人小梁细胞GRP78mRNA的表达；5.应用Western blot方法检测人小梁细胞GRP78mRNA的表达；6.应用细胞免疫化学染色法通过共聚焦显微镜观察GRP78蛋白与Myocilin蛋白的共定位情况。
结果 1.小梁网细胞鉴定：原代正常人和 POAG患者小梁网细胞均表达 FN、LN、NSE、vimentin; 第 VIII 因子阴性。2. 光镜下可见POAG患者与正常人，小梁细胞形态、分布上未见明显差别；用Tm、STS药物处理后，小梁细胞胞突减少，细胞体积缩小，密度下降，STS处理组较TM组变化明显，DMSO处理组小梁细胞形态无明显变化。3. MTS法检测：1 mM, 1 mM， 10 mM, 30 mM， 100 mM Tm或0.03mM, 0.1 mM，0.3 mM, 0.9 mM，1.2mM STS培养细胞24小时后，NTM与GTM增殖均受抑制，GTM受抑制更为明显，差别具有统计学意义，P＜0.05；4.Real-time PCR和Western blot显示相似的结果：1）原代 POAG患者小梁网细胞内GRP78水平明显低于正常人，差异有统计学意义(P < 0.05)。2）Tm可增加正常人及POAG患者小梁细胞内GRP78的表达水平，但后者的增高水平明显低于前者，差异有统计学意义（P < 0.05）。3）Tm对人小梁细胞内GRP78表达水平的影响明显大于STS，差异有统计学意义（P < 0.05）。4）GTM细胞对凋亡诱导剂STS的反应大于NTM细胞。5. 共聚焦显微镜观察显示1） POAG患者小梁细胞及Tm、STS处理过的正常人小梁细胞内GRP78蛋白与Myocilin蛋白共定位，而未处理的正常人小梁细胞内GRP78蛋白与Myocilin蛋白分布有差异；2）POAG患者小梁细胞及用Tm处理过的正常人小梁细胞内GRP78出现核周聚集现象，而在正常人小梁细胞及STS处理过的小梁细胞内则无此现象
结论 1.GRP78蛋白可能在内质网应激诱导产生的小梁细胞凋亡中起保护作用；2.POAG患者小梁细胞GRP78可能对内质网应激的反应能力下降，导致小梁细胞对损伤性刺激的敏感性增强；3.POAG患者小梁细胞GRP78可能与Myocilin蛋白存在相互作用，共同导致小梁细胞凋亡。