目的 观察特异性siRNA抑制视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)中CFH的表达对补体C3a激活的影响。
方法 常规培养ARPE-19细胞至50%融合状态时,靶向CFH-siRNA分子片段利用脂质体转染的方法转染ARPE-19 细胞,用Western blot的方法筛选siRNA转染的最佳浓度以及检测CFH的表达。采用实时荧光定量PCR(real time RT-PCR)和免疫荧光的方法分别从mRNA和蛋白水平检测CFH的抑制效果。用最佳浓度的CFH-siRNA分子片段干扰ARPE-19细胞24~48小时候后加入适量血清37℃反应30~120分钟,用ELISA测定血清中C3a补体激活水平。
结果 Western blot的结果显示与对照组相比,RNA干扰组CFH的表达明显降低,且CFH-siRNA的抑制效果是浓度依赖的,最佳浓度为100nM。real time PCR结果显示与对照组相比,干预组(100nM siRNA)的CFH表达被抑制了80%,组间差异有统计学意义(ANOVA,P<0.01)。免疫荧光显示干预组(100nM siRNA)的CFH表达明显比对照组低。与对照组相比,干预组(100nM siRNA)的C3a水平明显增加。
结论 特异性siRNA能明显降低RPE19细胞中CFH的表达,且CFH的抑制使补体激活增加。 |