目的 探讨pSilence.HIF1a.shRNA在人宫颈癌HeLa细胞培养模型中对HIF1a及其下游调控基因VEGF的抑制效果,为进一步的基因治疗有效性提供依据。 方法 HeLa人宫颈癌细胞以5x104 /孔种植于12孔细胞培养盘中,当细胞长至50-70%时,利用Lipofectamine 2000做转染剂,转染pSilence.HIF1a.shRNA,培养20小时后,制造细胞缺氧模型,一天后收获细胞上清液和细胞,分别检测上清液中的VEGF 水平和HeLa’s细胞中的HIF1amRNA和蛋白含量。 结果 qPCR和western结果表明,在培养的细胞中,正常氧的情况下,HIF1mRNA含量很低,在缺氧的情况下,HIF1amRNA及蛋白显著上升,HIF-1a.shRNA 转染后,可以特异有效地下调HIF1a蛋白和 RNA水平。与阴性对照相比, HIF-1a mRNA 水平减少 89 %。Western blot结果表明,与未转染的阴性对照比较,HIF1a蛋白水平可以显著敲除。细胞免疫组织化学结果同样支持这一结果。同时可以显著下调细胞上清液中的VEGF 蛋白水平 结论 我们发现,在培养的人宫颈癌细胞中,HIF1a.shRNA 可以特异有效地敲除HIF1a mRNA 和蛋白表达,并减少其下游调控基因VEGF蛋白表达下降。
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