目的 构建超支化多糖衍生物（HCPD）纳米基因载体，介导靶向的人NF-κB siRNA进入体外培养的人色素上皮（hRPE）细胞,进而抑制hRPE细胞NF-KB信号通路,探索预防糖尿病视网膜病变（DR）新生血管形成的新方法。
方法 1. N,N’-羰基二咪唑（CDI）活化法室温下合成出两种超支化多糖衍生物，红外光谱法(FTIR)分析化学结构，酸碱滴定法测定质子缓冲性能测试，扫描电镜及电位分析仪测定HCPD/siRNA复合物表征。2.CCK8法检测HCPD/siRNA复合物对hRPE细胞的毒性；选择HCPD作为siRNA转移载体, cy5荧光作为示踪,并以脂质体Lipofectamine TM 2000及PEI为对照转染hRPE细胞，流式细胞仪及共聚焦显微镜观测转染效率；通过改变siRNA的浓度、转染复合物质量比等条件参数,优化HCPD/siRNA转染方案。3.体外培养hRPE经细胞形态学、组织学及免疫细胞化学鉴定；以HCPD纳米颗粒为载体,将NF-κB siRNA转染hRPE,分别用RT-PCR、q RT-PCR等方法检测鉴定基因NF-KBp65在hRPE内的表达；
结果 1.红外光谱法得出HCPD可与多胺基团发生偶联，具有很强的的质子缓冲能力,HCPD/siRNA转染复合物的平均粒径100 nm-400nm；电位+10-+40mV。2、浓度及质量比对载体转染细胞的毒性及转染效率影响明显，浓度为0.1mg/mL,质量比10：1为转染细胞最佳条件,在最佳转染条件下，HCPD的转染效率与PEI及Lipofectamine TM 2000接近。3.成功培养及鉴定hRPE细胞,转染NF-κB基因的 siRNA的hRPE细胞分别经RT-PCR及q RT-PCR检测,证明NF-kb P65mRNA在hRPE内的表达下降。
结论 1．HCPD作为纳米基因载体具有稳定的理化性质及基因负载效率，为基因治疗中可选择的新的非病毒阳离子基因载体。2．HCPD安全低毒，其对siRNA转染效率主要依赖于HCPD与siRNA的质量比，同时受到siRNA的浓度等因素影响。3．HCPD负载靶向siRNA可调控hRPE细胞的NF-κB 信号通路，为治疗DR新生血管形成奠定了基础。 |
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