目的 研究以人羊膜为载体培养的猫角膜内皮细胞的活性,并进行传代,确定细胞增殖能力,为培养的人角膜内皮细胞移植技术的临床应用奠定基础。 方法(1)以酶消化法制备人羊膜载体,并附着固定于特制支架,通过复合消毒(无菌操作+抗生素浸泡+紫外线消毒)使之符合细胞培养要求;(2)体外培养猫眼角膜内皮细胞,每传代一次后抽取部分种植于人羊膜载体上,观察其活性、生长状况及生物学特性;于不同时间取出载体及细胞制备光、电镜标本,观察内皮细胞的形态及功能和羊膜载体的变化。 结果(1)羊膜处理后透明度可满足倒置显微镜观察要求,细胞层清晰可见,具有一定机械强度,复合消毒可满足细胞培养要求,无细菌或真菌污染,细胞生长良好;(2)倒置显微镜及扫描电镜观察:培养前三代猫角膜内皮细胞能在人羊膜上形成完整的内皮细胞单层,细胞密度约2500个/mm2;自第四代开始,细胞形态逐渐变异,密度减小,至第六代已明显衰变,不能形成完整细胞层;(3)种植后1周、2周、4周分别采取传代1次至6次细胞连同羊膜载体制备光、电镜标本进行观察,证实前3代培养的角膜内皮细胞可形成内皮细胞单层,保持接近正常内皮的形态学特点;台盼蓝染色见传代2周内羊膜细胞活性良好,无明显凋亡,4周后可见明显细胞凋亡及坏死;透射电镜可见凋亡小体;羊膜载体胶原结构紧密,与内皮细胞相容性良好,在培养基中结构基本保持稳定。 结论(1)猫角膜内皮细胞能够在体外培养形成完整的细胞单层;(2)以人羊膜为载体行培养的猫角膜内皮细胞前三代形态正常,传代后一周即可形成单层细胞,但培养4周后活性下降;(3)人羊膜载体在透明性和机械强度方面能够满足眼科手术要求,在培养基内较长时间内保持原有结构,与内皮细胞接合牢固,生物相容性良好。 |