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| 重组腺伴随病毒AAV介导GFP在SD大鼠视网膜中的表达 |
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作者：张华 赵家… 文章来源：北京协和医院眼科 100730 点击数：1790 更新时间：2004/6/29 
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| 目的 为了研究GFP基因导入青光眼模型的作用，构建并产生重组腺伴随病毒载体，观察GFP在SD大鼠视网膜中的表达。
方法 应用PCR技术，以质粒pGFP-N2为模板，扩增出hNT-4编码基因。将所得基因片段重组于pGEM-T Easy质粒，筛选得到含hNT-4基因的克隆。将GFP目的基因插入载体质粒pSSHGCMV的EcoR I – BamH I位点之间，构建重组腺伴随病毒载体质粒。用腺病毒辅助质粒pFG140代替野生型腺病毒，包装质粒pAAV/Ad及已构建重组腺伴随病毒载体质粒，三质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的143细胞系，包装rAAV。经蔗糖梯度离心法纯化、斑点杂交方法测定重组病毒滴度。将GFP重组腺伴随病毒pSSCMV-GFP注射到SD大鼠玻璃体腔内，并与空载体pSSHGCMV进行对照。
结果 成功构建了重组病毒质粒pSSHGCMV/ GFP。用腺病毒质粒代替野生型腺病毒不影响重组病毒的产生和滴度，而且可以减少野生型腺病毒的污染。用蔗糖梯度离心法离心获得rAAV，使用斑点杂交方法测定重组病毒滴度，杂交结果与已知浓度重组质粒杂交结果比较，获得了较高滴度的重组病毒。荧光显微镜观察结果：结果发现在GFP重组腺伴随病毒（rAAV/GFP）pSSCMV-GFP感染组中，在感染后24h几乎看不到有荧光，48h荧光较弱，此后荧光明显增强，72h时荧光较强，至120h（5d）时荧光更加集中且很强。当表达量高时，在细胞中聚集成团块状、颗粒装。在转染空载体重组腺伴随病毒（rAAV）pSSHGCMV的阴性对照组中，视网膜中始终无绿色荧光出现。
结论 成功制备了重组腺伴随病毒rAAV/GFP，GFP重组腺伴随病毒（rAAV/GFP）在SD大鼠视网膜中的成功表达，为青光眼基因治疗实验奠定了基础。
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| 会议投稿录入：毛进 责任编辑：毛进 |
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