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| 腺伴随病毒介导的脑源性神经营养因子基因对体外培养的大鼠视网膜神经节细胞的转染 |
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作者：李海燕 赵… 文章来源：北京协和医院 点击数：1633 更新时间：2005/5/18 20:33:48 
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| 目的 探讨应用重组腺伴随病毒载体介导的脑源性生长因子基因（rAAV-BDNF）能否对体外培养的鼠视网膜神经节细胞（RGCs）进行转染，检测外源性BDNF基因在细胞内转录和翻译水平的表达情况，并判断rAAV-BDNF转染后对RGCs生长活性和凋亡的影响。
方法 1. 应用rAAV-BDNF对体外培养2天的RGCs进行转染，MOI＝105，继续培养7天。采用Trizol一步法提取转染细胞的总RNA。根据基因库中BDNF序列和AAV载体基因设计特异性引物，应用RT-PCR技术对外源性BDNF基因在RGCs细胞中mRNA水平的表达进行检测。
2. 分别在rAAV-BDNF转染7天和14天后收集细胞培养液，同时收集未转染细胞的培养液。应用ELISA方法对每组培养液中的BDNF含量进行检测。
3. 分别在转染后3天、6天和9天时，对rAAV-BDNF转染细胞、未转染细胞以及加入BDNF培养的细胞进行MTT比色分析，比较不同组的细胞生长活性。
4. 应用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪，检测rAAV-BDNF转染细胞、未转染细胞以及加入BDNF培养的细胞的凋亡比率。
结果 1. 提取的rAAV-BDNF 转染细胞的总RNA完整，无降解。RT-PCR检测结果显示，转染细胞表达外源性BDNF基因，而未转染细胞不表达。
2. rAAV-BDNF 转染细胞的培养液中BDNF的含量：转染7天后为616.1±40.0pg/mL，转染14天后为1075.1±48.7 pg/mL。
3. MTT比色结果显示：在转染3天和6天后，rAAV-BDNF转染细胞与未转染细胞的OD值无显著性差异（p>0.05），在转染9天后，转染细胞的OD值高于未转染细胞（p<0.01）。在以上时间点，加入BDNF培养的细胞的OD值均高于未转染细胞（p<0.01）。
4. 流式细胞仪检测结果显示rAAV-BDNF转染细胞和加入BDNF培养的细胞的凋亡比率明显低于未转染细胞的凋亡比率 （p<0.05）。
结论 rAAV-BDNF可有效转染体外培养的鼠RGCs，转染细胞可在转录水平和翻译水平表达外源性BDNF基因，且生长活性改善，凋亡减少。这为青光眼视神经保护的基因治疗提供了理论和技术支持。
关键词 重组腺伴随病毒载体；脑源性生长因子；视网膜神经节细胞；体外；转染；逆转录-聚合酶链反应；酶联免疫吸附试验；凋亡
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| 会议投稿录入：lihaiyan 责任编辑：毛进 |
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