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| 睫状神经营养因子腺相关病毒载体的构建 |
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作者：朱益华 … 文章来源：福建医科大学附属第一医院 点击数：1674 更新时间：2005/6/18 21:36:37 
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| 目的: 利用分子生物学技术克隆大鼠睫状神经生长因子（CNTF）基因片段,构建腺相关病毒表达载体，为探讨CNTF对大鼠视网膜神经节细胞的影响奠定基础。
方法: 1. 采用基因拼接的方法克隆大鼠CNTF的ORF（开放读码框）DNA片段，所得的DNA片段经SalⅠ和XbaⅠ双酶切后定向插入腺相关病毒载体AAV-MCS质粒中构建成pAAV－CNTF。2.pAAV-CNTF和另外两种质粒pHelper、pAAV-RC通过脂质体共转染AAV-293细胞，包装成带有CNTF的重组腺相关病毒。收集病毒颗粒，同时以pAAV－LacZ作为报告基因和pHelper、pAAV-RC三种质粒在和pAAV－CNTF完全相同的条件下共转染AAV-293细胞，通过β—半乳糖苷酶染色测定转染率，收集病毒原液。以不同稀释梯度的病毒感染HT－1080细胞，通过β—半乳糖苷酶染色测定病毒滴度。
结果:1.测序证实CNTF与GeneBank提供的原始序列完全一致。酶切鉴定与PCR筛选证实重组质粒和预期结果完全一致。2.藉β—半乳糖苷酶原位染色法检测报告基因LacZ在人纤维肉瘤细胞（HT－1080）中的表达测得重组病毒滴度为7.0×107个∕ml。
结论: 本实验成功地克隆了CNTF基因并构建了其腺相关病毒表达载体，为进一步研究用CNTF基因转染的方法来促进视神经损伤修复奠定了基础。
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| 会议投稿录入：zhuyihua 责任编辑：毛进 |
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