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| 毒蕈碱受体在人角膜缘和角膜、结膜表达的研究 |
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作者：王传富 刘… 文章来源：青岛大学医学院附属医院眼科 266003 点击数：1778 更新时间：2004/5/25 
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| 目的：研究人角膜缘和角膜、结膜是否表达毒蕈碱受体1-5亚型（m1-5）。
材料与方法：
从人角膜缘组织分离上皮细胞并培养至第1-2代。RT-PCR 分析培养人角膜缘上皮细胞中角蛋白3、12 mRNA的表达。免疫荧光染色研究增殖细胞核抗原（PCNA)、p63和角膜上皮分化标志-角蛋白3、12（K3、K12)、外皮蛋白、连接蛋白43在培养人角膜缘上皮细胞中的表达。用植块法培养角膜基质成纤维细胞。从培养的角膜缘上皮细胞和角膜基质成纤维细胞中提取总RNA和蛋白质，行毒蕈碱受体1-5亚型RT-PCR和 Western Blot。免疫荧光染色研究m1-5在人角膜缘和角膜组织和培养细胞的分布。
从人结膜组织分离上皮细胞和成纤维细胞并培养至第1-2代，提取培养细胞的总RNA和蛋白质，行毒蕈碱受体1-5亚型RT-PCR和 Western Blot。免疫荧光染色研究m1-5在人结膜组织和培养细胞的分布。Brdu酶联免疫吸附试验检测毒蕈碱受体激动剂carbachol对结膜成纤维细胞增殖的影响。
结 果：
人角膜缘上皮细胞在丝裂霉素C处理的3T3饲养层细胞上形成边界清楚的克隆。培养细胞中K3和K12 mRNA的水平明显低于上皮组织中的水平。培养细胞的多数克隆不表达K3、K12、外皮蛋白，仅少数克隆表层1-2个细胞呈阳性表达。所有细胞PCNA染色阳性。p63在克隆基底层细胞呈强阳性，在K3阳性的表层细胞中呈弱阳性。连接蛋白43在少数克隆中呈阳性表达。暴露于气液面后，培养的角膜缘上皮细胞形成3-5层结构，外皮蛋白在外层细胞表达阳性，连接蛋白43在基底层的细胞中表达，而K3阳性的细胞很稀疏。
培养人角膜缘上皮细胞和角膜基质成纤维细胞中存在编码毒蕈碱受体1-5亚型的mRNA。Western blot在培养人角膜缘上皮细胞和角膜基质成纤维细胞中发现m1-5的免疫反应带，各自的分子量大小约为m1 55kD；m2 55kD；m3 65kD；m4 55kD；m5 60kD。免疫荧光染色表明毒蕈碱受体1-5亚型在培养人角结膜上皮细胞和基质成纤维细胞中呈阳性表达，主要分布在细胞膜和细胞浆中。人角膜缘和角膜组织上皮层、内皮细胞层表达毒蕈碱受体1-5亚型。
RT-PCR结果表明编码毒蕈碱受体1-5亚型的mRNA存在于培养人结膜上皮细胞和成纤维细胞中。Western blot在培养人结膜上皮细胞和成纤维细胞中发现m1-5的免疫反应带。免疫荧光染色表明毒蕈碱受体1-5亚型在培养人结膜上皮细胞和成纤维细胞中呈阳性表达。人结膜组织上皮层包括杯状细胞表达毒蕈碱受体1-5亚型。毒蕈碱受体激动剂carbachol促进结膜成纤维细胞的增殖。
结论：人角膜缘上皮细胞在丝裂霉素C处理的3T3饲养层和SHEM的培养环境下表现出类似角膜缘上皮层基底细胞的特点。毒蕈碱受体1-5亚型广泛存在于角膜缘和角膜、结膜中，毒蕈碱受体激动剂carbachol促进结膜成纤维细胞的增殖，提示该G蛋白受体对细胞功能有调节作用。 |
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| 会议投稿录入：毛进 责任编辑：毛进 |
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